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人唾液皮質(zhì)醇(SC)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書

更新時間:2023-12-15      瀏覽次數(shù):845

人唾液皮質(zhì)醇(SC)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒使用說明書


Human salivary cortisol(SC) ELISA Kit


產(chǎn)品貨號RJ13602

產(chǎn)品規(guī)格:96T/48T

實驗原理:

試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被有人唾液皮質(zhì)醇(SC)抗體的微孔中,依次加入本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的抗原,中間經(jīng)過溫育洗滌,用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人唾液皮質(zhì)醇(SC)負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。

試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

預(yù)包被96孔酶標(biāo)板

Pre-coated Assay Plate

8×12

8×6

標(biāo)準(zhǔn)品

Standard

2

1

按說明書進行稀釋

通用稀釋液

Universal Diluent

2x20mL

1x20mL

濃縮HRP-抗原 HRP-antigen(100×)

60μL

30μL

按說明書進行稀釋

2洗滌液

Wash Buffer (2)

2x10mL

1x10mL

按說明書進行稀釋

 底物TMB

TMB Substrate

10mL

5mL

終止液

Stop Solution

6mL

3mL

封板膜

Plate Sealer

4

4

說明書

Instruction Manual

1

1

預(yù)包被96孔酶標(biāo)板

Pre-coated Assay Plate

8×12

8×6


 

試劑盒參數(shù):

性能


靈敏度

0.187ng/mL

檢測范圍

0.312-20ng/mL

重復(fù)性

板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于10%.

特異性

可檢測樣本中人的SC,且與其類似物無明顯交叉反應(yīng).

 

需自備的設(shè)備及試劑: 

1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀

2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準(zhǔn)備若干個標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.


 

樣本處理及要求:

1. 試劑盒檢測范圍不等同于樣本中待測物的濃度范圍,建議實驗前通過相關(guān)文獻預(yù)估樣本中待測物的濃度并通過預(yù)實驗確定樣本的實際濃度情況。如果樣品中待測物濃度過高或過低,請對樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。

2. 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中,建議做預(yù)實驗驗證其檢測有效性。

3. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4. 血漿:EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細(xì)胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)物上1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

7. 其它生物標(biāo)本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測。

8. 樣品外觀:樣品應(yīng)清澈透明,懸浮物應(yīng)離心去除。

9. 樣品保存:樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個月內(nèi)檢測),或-80℃(6個月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融,標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。


檢測前準(zhǔn)備工作

1. 提早10分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制:加入1mL通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品,靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為20ng/mL),然后按照以下濃度:20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0ng/mL進行稀釋。

比稀釋方法:取7支 EP管,每管中加入500μL通用稀釋液,500pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成250pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液,按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔,不需要再從倒數(shù)第二管中吸取液體,具體如下圖。


3. HRP-抗原工作液配制:使用前15分鐘將濃縮HRP-抗原于1000×g離心1分鐘,以通用稀釋液將100×濃縮HRP-抗原稀釋成1×工作濃度(例:10μL濃縮液+990μL通用稀釋液),當(dāng)日使用。

4. 1×洗滌液配制10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中(從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正?,F(xiàn)象,放置室溫,輕搖均勻,待結(jié)晶溶解后再配置)。

操作步驟:

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣:分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照50μl每孔加入相應(yīng)孔中,空白孔加入50μL通用稀釋液,緊接著每孔加入50μL HRP-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。(建議:將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測試,從而減少基質(zhì)效應(yīng)對測試結(jié)果的誤差影響,最后計算樣本濃度時需乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測中建議設(shè)立復(fù)孔)。

3. 洗板:棄去液體,每孔加入300μL 1x洗滌液,靜置1分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板3次(也可用洗板機洗板)。

4. 加底物:每孔加入底物(TMB)90μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育15分鐘。

5. 加終止液:每孔加入終止液50μL,立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

 

 

結(jié)果判斷

1. 計算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值。以濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限,應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考,實驗者需根據(jù)自己的實驗建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

濃度(ng/mL)

20

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0

OD

0.19

0.24

0.31

0.55

0.97

1.38

1.96

2.52

 

 

 

微信圖片_20231115093315.png


 

 

 

 

注意:本圖僅供參考,應(yīng)以同次試驗標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算標(biāo)本含量。


試劑盒性能:

1. 重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于10%。

2. 回收率:在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個不同濃度水平的人SC,計算回收率

樣本類型

范圍

平均回收率

血清(n=8)

81-101

96

血漿(n=8)

92-105

101


3. 線性稀釋:分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人SC,在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋,評估線性。

稀釋比例

回收率(%

血清

血漿

12

范圍(%

83-95

88-96

平均回收率(%

91

93

14

范圍(%

89-104

87-108

平均回收率(%

93

98


注意事項

1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

9. 不能使用過期產(chǎn)品。

10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。


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